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Im Jahr 2000 wurde am IFZ eine Anlage zur Messung von DNA-Microarrays oder BioChips installiert. Diese Anlage erlaubt es, mit Hilfe industriell gefertigter BioChips die Aktivität von Tausenden von Genen in einem Arbeitsgang zu messen. Möglich wurde der Einstieg in die Microarray-Technologie durch Fördermitteln des Landes NRW im Rahmen einer BioChip-Initiative. Die Einrichtung dieses Labors und die zeitgleich geförderte Startphase der Forschungsvorhaben wurde durch eine großzügige Anschubfinanzierung aus dem IFORES-Programm des Fachbereichs Medizin der hiesigen Universität und durch die IFZ-Fördervereinigung unterstützt.
Das Affymetrix GeneChip System besteht aus Hybridisierungsofen (nicht abgebildet), Scanner (links), PC Workstation und Wasch/Färbe-Station.
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Von der RNA zum Hybridisierungtarget
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Die in der totalen RNA enthaltenen protein-kodierenden mRNAs (ca. 0.2-0.4%) werden mit Hilfe eines T7-d(T)21 Primers und des Enzyms Reverse Transkriptase (RT) zunächst in einzelsträngige cDNA umgeschrieben, danach wird der komplementäre cDNA-Strang durch DNA-Polymerase I, DNA-Ligase und RnaseH synthetisiert. Die Einführung der T7-Promotersequenz erlaubt es in einer sogenannten in vitro Transkriptionsreaktion mit Hilfe von T7-RNA-Polymerase die Umschreibung der cDNA in biotinylierte Antisense-cRNA, die partiell komplementär zu den auf dem Chip enthaltenen PM-Oligonukleotiden ist. Da jedes cDNA-Molekül viele Male abgeschrieben wird (lineare Amplifizierung), erreicht man erst durch diesen Schritt genügend Material für eine Mikroarray-Hybridisierung (ca. 10 µg cRNA).
Die biotin-markierten cRNA (Target) werden nach Fragmentierung auf den Array hybridisiert. Nach dem Auswaschen nicht-komplementärer cRNA werden die gebundenen komplementären cRNAs durch Bindung von Streptavidin gekoppeltem Phycoerythrin gefärbt. Dieser Fluoreszensfarbstoff kann dann durch Aktivierung mit Laserlicht in einen speziellen Scanner gemessen und quantifiziert werden.
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Image-Analyse
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Schritt 1:Absolute Analysis. Anders als bei vielen cDNA-Arrays wird bei der Affymetrix-Technologie pro Array nur eine Probe (Target) hybridisiert, d.h. dass für die Kontrolle und die experimentelle RNA jeweils ein Chip hybridisiert wird. Direkt nach dem Abschluss des Scannens eines Arrays werden die Hybridisierungs-Signale der einzelnen Oligonukleotide der ursprünglichen Images (.DAT) berechnet und in einem Pseudo-Image (.CEL) abgelegt. Danach erfolgt unter Berücksichtigung der Signale der Mismatch-Oligonukleotide (MM), einer Background-Korrektur und dem Ausschluss von Outlier-Signalen die Berechnung des Probeset-Signals (One-Step Tukey’s Biweight Estimate) und des Detection p-values (Wilcoxon’s signed-rank test). Das Signal ist ein relatives Maß der Häufigkeit des Transkripts in der analysierten Probe, während der Detection p-value die Verläßlichkeit der Messung beschreibt und den Detection Call (P, M, A) bestimmt.
Bei diesem Prozess werden die verschiedenen Array-Images üblicherweise normalisiert, um Unterschiede nicht-biologischen Ursprungs (unterschiedliche Mengen cRNA im Hybridisierungscocktail, etc) auszugleichen. Am gebräuchlichsten ist hier „global scaling“, bei dem die Arrays auf eine vorgewählte Durchschnitts-Intensität (nach Ausschluß der 2% niedrigsten und höchsten Signale) eingestellt werden. Daneben sind andere Verfahren, wie z.B. die Normalisierung auf Housekeeping-Gene oder andere Kontrollen, möglich. Als Resultat erzeugt MAS5.0 eine Tabelle (sogenannten CHP-File), die als Text-Datei exportiert werden kann und in der für jeden Probeset Signal, Detection p-value, Detection Call und einige andere Parameter angegeben sind.
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Schritt 2 Schritt 2:Comparison Analysis
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Erst danach werden Expressionsunterschiede zwischen Kontroll- und experimentellem Array in der vergleichenden Analyse mit MAS5.0 errechnet. Dabei wird der Expressions-Unterschied für jeden Probeset in Form einer Signal Log Ratio (Basis 2) berechnet. Parallel dazu wird der Change p-value kalkuliert, der nach Abgleichung gegen einstellbare Cut-offs in die Change Calls Increase (I), Marginal Increase (MI), No Change (NC), Marginal Decrease (MD) und Decrease (D) umgesetzt wird. Die Berechnung des Change p-values erfolgt nach dem Wilcoxon’s signed-rank test, in den die jeweiligen 11 Signaldifferenzen PM-MM eines Probesets auf den beiden zu vergleichenden Arrays als Variablen eingehen. Wie bei der Absoluten werden auch bei der Comparison Analysis die Arrays normalisiert. Die Ausgabe der Ergebnistabelle kann wieder in Form einer Text-Datei erfolgen.
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Alternative Auswertungsmethoden
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Neben der Auswertung mit MAS5.0 sind alternative Methoden und Programme zur Berechnung der Signale entwickelt worden, die zu etwas unterschiedlichen Ergebnissen führen können. Breitere Beachtung gefunden haben Algorithmen, die in dCHIP (http://www.biostat.harvard.edu/complab/dchip/) und RMAExpress (http://stat-www.berkeley.edu/users/bolstad/RMAExpress/RMAExpress.html) zur Anwendung kommen.
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