Unsere Empfehlung zur Template-Aufreinigung
Plasmid-DNA
Eine zuverlässige Aufreinigung der DNA mit guter Eignung als Template für die Sequenzierung ist über die Kits von QIAGEN zu erzielen. Bitte beachten Sie bei der Aufreinigung gemäß QIAGEN-Protokoll unsere folgenden Hinweise:
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Die NaOH-Behandlung (Puffer P2) sollte zwischen 3 und 5 Minuten, jedoch keinesfalls länger, dauern.
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Fällen, Zentrifugation und Waschen der DNA stets bei Raumtemperatur (bei Temperaturen unter 4 °C fallen störende Salze aus)
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Pellets gründlich waschen und gut trocknen (EtOH-Reste hemmen die Sequenzierreaktion)
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Lösen der DNA nur in hochreinem Wasser (z.B. Merck, Best.-Nr. 115333), da Puffer und Salze in der DNA-Lösung die Sequenzierreaktion hemmen können.
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Die Qualität der Plasmid-DNA kann schon durch den Wirtsstamm beeinflußt werden. Wir empfehlen DH5.
PCR-Produkte
Die Ausgangs-PCR sollte gut optimiert sein und nach Möglichkeit nur ein spezifisches Produkt ergeben. Üblicherweise sollte ein PCR-Reaktionsvolumen von 50 bis 100µl ausreichend sein, um die für die Sequenzierung erforderliche Template-Menge zu erhalten.
Eine zuverlässige Abtrennung der unerwünschten nicht-eingebauten Primer, Nukleotide etc. von der Template-DNA kann über die Kits von QIAGEN (Aufreinigung über Agarose Gele) erreicht werden.
Alternativ können enzymatische Methoden (z.B. mit ExoSapIt der Firma USB) oder Methoden auf Grundlage der Ultrafiltration verwendet werden.
Bitte beachten Sie bei der Ultrafiltration (z.B. mit Microcon 100 für PCR-Produkte über 120 bp Länge, Millipore; Best.-Nr. 42412):
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PCR-Ansatz nach Amplifikation mit hochreinem Wasser (z.B. Merck, Best.-Nr. 115333) auf 500 µl auffüllen
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Zentrifugation bei möglichst genau 500 g
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Retentat der ersten Zentrifugation mit 400 µl hochreinem Wasser auffüllen und erneut bei 500 g zentrifugieren
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Hier eine Übersicht über die Anwendung der verschiedenen Aufreinigungsmethoden:MethodeAnwendungVorteileNachteileGel-aufreinigung(QUIAGEN)
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unabhängig von der Qualität
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bei unspezifischen PCR Produkten und Primer Dimeren
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zuverlässige Beseitigung unerwünschter PCR Produkte und Primer Dimeren
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variabel
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schlechte Ausbeute
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zeitaufwendig
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UV Licht kann die DNA beschädigen
Säulen-aufreinigung (MILLIPORE)-
Aufreinigung des reinen PCR Produktes und wenn Nebenprodukte kleiner als 100bp vorhanden sind
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schnell und einfach
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relativ teuer
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beseitigt keine unspezifischen PCR Produkte von 100 oder mehr Basenpaaren
enzymatische Aufreinigung(USB) z.B. ExoSAP-It-
nur anwendbar, wenn ein spezifisches PCR Produkt vorliegt
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schnell und einfach
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kann im PCR Cycler durchgeführt werden
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günstig
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hohe Ausbeute
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einfaches Handling auch für viele Proben
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beseitigt keine unspezifischen PCR Produkte
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beseitigt keine Primer Dimere
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