Troubleshooting

Allgemeine Phänomene bei der Sequenzierung

Blobs

1a) Dye Blobs

  • Dye Blobs sind große farbige Peaks am Anfang der Sequenz, die über mehrere Basen gehen
  • Dye Blobs sind ein häufiges Artefakt der Aufreinigung und stören selten die Auswertung, sollten sie aber trotzdem stören, so geben Sie uns kurz Bescheid, dann werden wir die Reaktion wiederholen
  • Dye Blobs wandern je nach Chemie (BD 1.1.; 3.1.) anders-> kann auch an Seq-Reaktion liegen -> wenn schlechte Reaktion (z.B. schlechtes Verhältnis, DNA u. Primer), dann mehr ddNTPs übrig
  • Lösung: nach Möglichkeit auf ausgeglichene Reaktion achten! Weniger DNA ist mehr!
  • Bei Sephadexaufreinigung nicht in die Säule stechen oder Lösung an Säule vorbei pipettieren
  • viele Dye Blobs können auch von einer Fluoreszenzverunreinigung herrühren (Rohdaten checken und ob bei allen Proben)
  • Lösung:   Fluoreszenzvermeidung (!!!):
  • keine bunten Tubes
  • keine Edding Beschriftungen (nach Möglichkeit nur Rand mit Kürzel und Datum versehen, nicht auf der Platte!)
  • saubere Reagenzien, Ständer und auch Pipettenboxen mal spülen
  • sauber auf Sephadexsäule pipettieren! (nicht berühren oder daneben pipettieren)
  • regelmäßig frisches Wasser (nur Merck!) benutzen ggf. auch in kleineren Aliquots
  • saubere Probenvorbereitung ist unumgänglich für eine gute Sequenz!!!

1b) Einzelner roter Peak (T) am Anfang:

  • einzelner roter T-Peak am Anfang der Sequenz
  • deutet darauf, dass der pH vom Wasser zu niedrig ist.
  • -> Standzeit kontrollieren und ggf. erneuern, generell lieber kleine Aliquots Wasser machen!

1c) „schleichende“ schwarze Peaks

  • schwarze Peaks über mehrere Basen, entstehen durch G- Degradation im Formamid
  • wird durch wiederholtes laufen lassen schlimmer
  • Lösung: check Formamid Aufbewahrung! Platten nie lange bei Raumtemperatur und im Sequencer stehen lassen! (bitte rausholen, wenn fertig, auch im Interesse anderer!)
  • Formamid immer kühl lagern ( im Kühlschrank max. eine Woche) , am besten  -20°C!

Mobility Shifts und C- Schultern

  • Mobility Shifts sind ineinander gezogene Peaks, fast wie SNPs meist innerhalb der ersten 100 bp (oft A und G)
  • C- Schultern sind Hubsel = Schultern nach rechts überwiegend an C-Peaks
  • Entstehen durch das verschiedene Laufverhalten der Farbstoffe oder Beeinflussung des Laufverhaltens ggf. durch Inhibitoren
  • Vor allem CA Regionen für Mobility Shifts sehr anfällig
  • Lösung: -> rückwärts Sequenz checken, wenn vorhanden!, Lauf mit längerer Laufzeit wiederholen; Primer anders setzen, check auf Inhibitoren

Basislinie und Rohdaten

  • stets auf Basislinie achten (s. Rohdaten)!
  • wenn rauschen: nur in einer Probe oder in allen? Wenn in allen -> Standard laufen lassen, wenn rauschen dort auch auftritt, liegt ein Problem mit Gerät vor, wenn nicht, kommt das Problem aus der Probe
  • Wenn sich ganz hinten Basislinie hebt, ist Ende der Sequenzierreaktion erreicht
  • Wenn Basislinie vorne erhoben, darauf achten, ob es von Lauf zu Lauf schlimmer wird -> ggf. check mit Standard => kann von Septen kommen! Gründlich waschen, oder erneuern, wenn zu matt!)
  • Bei Kontamination zeigt sich ein spezifisches Muster (wie Loch), auch hier darauf achten, ob bei allen Proben (Block Kontamination?) oder nur bei einigen, oder einzelnen (ggf. Verunreinigungen durch Proteine/Detergenzien etc.)
  • „Spikes“ in Rohdaten hinten = Ausgasungen; Lösung: runterzentrifugieren, nochmal laufen lassen, dann sollte es ok sein
  • „Spikes“ in Rohdaten (überall, nicht lokalisiert) -> Harnstoffkristalle, bei Zunahme ggf. Polymer wechseln ( in Sequenz als Überlagerung aller Farben und spitzer Peak zu erkennen)
  • Pull up/ Pull down Peaks in Rohdaten = Überladene Sequenzen (=zu viel DNA->check Annotations!) Wenn Annotations ok, schauen, ob pull up/ pull down Peaks auch bei anderen Proben auftreten und ggf. neue Matrix erstellen

Auflösungsverlust

  • unter Auflösungsverlust versteht man breitere Peaks, die nicht bis unten (einzeln) getrennt sind
  • ein Auflösungsverlust ab ca. 600-700bp ist normal und technisch bedingt
  • wenn mitten in der Probe Auflösungsverlust und danach normal (vor allem beim 3130XL), dann ist die Ursache Staub
  • Staub am Gerät checken und ggf. Filter wechseln; Probe wiederholen
  • generell durch schlechtes Polymer, Kapillaralterung oder Undichtigkeit, aber auch durch Kontamination (ggf. Verunreinigungen durch Proteine/Detergenzien etc.)
  • auch hier checken, ob Problem bei allen Proben auftritt, oder nur bei einzelnen

Überlagerungen

  • am Anfang der Sequenz = mögl. Primer Dimere
  • wenn Sequenz um eins versetzt nach rechts wegläuft = N-1 Primer = Fehler bei der Synthese oder zu häufiges auftauen
  • Überlagerungen können auch durch ein 2. PCR Produkt hervorgerufen werden, auch hier auf dem Gel auf 2.PCR Produkt achten!
  • Überlagerungen können aber durchaus auch von Mutationen kommen (Heterozygotie, Insertion/ Deletion)
  • auch bei Stretches (mehrere gleiche Basen nebeneinander) kommt es zur Überlagerung durch Polymerase Slippage (hinter dem Stretch). Dieser lässt sich leider auch nicht vermeiden.
  • Lösung: ggf. kleinere Primer Aliqouts, wenn Problem schon bei der ersten Sequenz des Primers, ist es ein Fehler der Primerfirma (Reklamation), bei Primer Dimeren besseres Gel fahren und sauberer ausschneiden oder ggf. neue Primer bestellen

generelle Tipps

  • Stets auf Rohdaten und Annotations achten! => Auf Verunreinigungen achten und abstellen (Salze, Detergenzien, Dreck etc. )

Ausgeglichenheit und Optimierung der Sequenzreaktion

  • auch die DNA Menge hat einen Einfluss auf eine otimale Sequenz!
  • deshalb unbedingt DNA Menge vorher messen und uns mitteilen!!!
  • zu viel DNA wurde u.a. eingesetzt, wenn Sequenz abflachend ist
  • Sequenz kann auch abflachend sein, wenn Probe verunreinigt ist (ggf. auch hoher Hintergrund, auffällige Rohdaten)
  • Primer checken bei Überlagerungen (Dimere?; 2. PCR Produkt)
  • Primer bitte auf 5µM einstellen (zu viel Primer ergibt auch keine optimale Sequenzierreaktion)
  • Primer Annealing Temperaturen bitte mit angeben!
  • Proben nach Möglichkeit in Merck Wasser gelöst, so sauber wie möglich, Floureszenzen vermeiden!
  • AT und GC reiche Templates lassen sich mit einem optimierten Protokoll besser sequenzieren, sollten Sie ein solches Template haben, so teilen Sie uns das in Ihrem Interesse mit!!!

SNPs

  • ggf. Mixed Bases Option der Sequencing Analysis benutzen

Bisulfit

  • Bisulfit ist schwierig zu sequenzieren, sollten Sie Bisulfit behandelte Proben haben, so lassen Sie uns dies wissen!
  • Die Bisulfitbehandlung sollte demnach so sauber wie möglich ausgeführt werden und die Proben für die Sequenzierung anschließend in Wasser gelöst werden
  • Bei Bisulfit Proben sollten Sie uns unbedingt die DNA Menge mitteilen, da hier in die Reaktion nur sehr wenig DNA eingesetzt wird!
  • ggf. können wir hier auch bessere Sequenzen durch ein optimiertes PCR Protokoll erreichen.

Haben Sie generell Probleme mit Ihren Sequenzen oder haben Phänomene beobachtet, oder Probleme beim Auswerten durch Blobs oder ähnliches, so teilen Sie uns das mit und wir werden versuchen ggf. mit Ihnen das Problem abzustellen oder die Reaktion zu wiederholen.

Kontakt


Institut für Humangenetik
Universitätsklinikum Essen
Virchowstraße 171
45147 Essen

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